膠原探索
Ⅱ型膠原蛋白對(duì)人軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
蔣萍，蔚芃，趙明才，陳瓊，王梓(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，四川省南充市637000)蔣萍，女，1983年生，四川省南充市人，漢族，2012年川北醫(yī)學(xué)院畢業(yè)，碩士，醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)損傷修復(fù)研究。?通訊作者：蔚芃，主任醫(yī)師，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，四川省南充市637000?文章亮點(diǎn)：1.膠原蛋白作為天然高分子生物材料已被證實(shí)可作為軟骨組織工程支架材料，并且它作為底物能刺激軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，可用于體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，但關(guān)于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭(zhēng)議。2.實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性使用Ⅰ、Ⅱ型膠原包被培養(yǎng)板和普通培養(yǎng)板同時(shí)培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞，研究Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對(duì)人軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。發(fā)現(xiàn)膠原蛋白包被培養(yǎng)板培養(yǎng)軟骨細(xì)胞優(yōu)于普通培養(yǎng)板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞時(shí)更能維持細(xì)胞形態(tài)，延長(zhǎng)去分化現(xiàn)象出現(xiàn)的時(shí)間，更利于細(xì)胞再分化。關(guān)鍵詞：生物材料；軟骨生物材料；Ⅰ型膠原蛋白培養(yǎng)板；Ⅱ型膠原蛋白培養(yǎng)板；人軟骨細(xì)胞；體外培養(yǎng)主題詞：膠原Ⅰ型；膠原Ⅱ型；軟骨細(xì)胞基金資助：四川省衛(wèi)生廳項(xiàng)目?摘要背景：實(shí)驗(yàn)證明膠原蛋白底物具有刺激成軟骨的作用，但關(guān)于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭(zhēng)議。目的：觀察Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對(duì)體外培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法：將P3代人軟骨細(xì)胞分別加入普通培養(yǎng)板、Ⅰ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板、Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)10d內(nèi)，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；培養(yǎng)28d后，采用ELISA法、聚合酶鏈反應(yīng)、二甲基亞甲基藍(lán)比色等方法檢測(cè)3種培養(yǎng)板中軟骨細(xì)胞分泌Ⅰ膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白及糖胺多糖的量。?結(jié)果與結(jié)論：Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板中軟骨細(xì)胞數(shù)量最多，增殖速度為Ⅰ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板的2倍、普通培養(yǎng)板的5倍。Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板中軟骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白最少，與普通培養(yǎng)板板檢測(cè)結(jié)果差異有顯著性意義(P<0.01)，與Ⅰ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板檢測(cè)結(jié)果差異無顯著性意義；Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板中軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原蛋白、糖胺多糖最多，與其他兩種培養(yǎng)板檢測(cè)結(jié)果差異有顯著性意義（P<0.01）。表明膠原蛋白包被培養(yǎng)板培養(yǎng)軟骨細(xì)胞優(yōu)于普通培養(yǎng)板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞時(shí)更能維持細(xì)胞形態(tài)，延長(zhǎng)去分化現(xiàn)象出現(xiàn)的時(shí)間，更利于細(xì)胞再分化。蔣萍，蔚芃，趙明才，陳瓊，王梓.Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對(duì)人軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J].中國(guó)組織工程研究，2014，18(30):4845-4850.?EffectoftypeIortypeIIcollagenonbiologicalcharacteristicsofhumanchondrocytes?JiangPing,Master,Physician,DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,SichuanProvince,ChinaCorrespondingauthor:WeiPeng,Chiefphysician,DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,SichuanProvince,ChinaAccepted:2014-05-21?JiangPing,WeiPeng,ZhaoMing-cai,ChenQiong,WangZi(DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,SichuanProvince,China)?AbstractBACKGROUND:Experimentshaveshownthatthecollagensubstratehasthecapabilityofstimulatingcartilagegeneration,butthestimulatingroleofdifferenttypesofcollagensubstratesremainscontroversial.OBJECTIVE:ToinvestigatetheeffectoftypeIandtypeIIcollagenonthebiologicalcharacteristicsofhumanchondrocytesculturedinvitro.METHODS:Humanchondrocytesatpassagewereculturedontotheordinarycultureplates(ordinaryplate),typeIcollagen-coatedcultureplates(typeIplate),andtypeIIcollagen-coatedcultureplates(typeIIplate).CellgrowthcurvesweredeterminedbyMTTmethodaftercellswereculturedfor10days.ByELISA,PCR,and1,9-dimethylmethylenebluetechnology,typeIandtypeIIcollagenandglycosaminoglycancontentswerequantitativelydetectedincartilagecells28daysafterculture.RESULTSANDCONCLUSION:ThenumberofcartilagecellswasthehighestintypeIIplate,whichwastwiceofthatintypeIplateandfivetimesofthatinordinaryplate.CartilagecellsintypeIIplatesecretedtheleastamountoftypeIcollagen,whichshowedsignificantdifferencescomparedwiththeordinaryplate(P<0.01)andhadnostatisticallysignificantdifferencewithtypeIplate(P>0.01).CartilagecellsintypeIIplatesecretedthemostamountoftypeIIcollagenandglycosaminoglycan,showingsignificantdifferencescomparedwiththeothertwoplates(P<0.01).Thecartilagecellsculturedincollagenplatesarebetterthanthatculturedinordinarycultureplate,typeIIcollagencultureplateisbetterthantypeIcollagencultureplateinmaintainingcellshape,extendingthededifferentiationpattern,andpromotingcelldifferentiation.Subjectheadings:collagentypeI;collagentypeII;chondrocytesFunding:agrantbySichuanProvincialHealthMinistry?JiangP,WeiP,ZhaoMC,ChenQ,WangZ.EffectoftypeIortypeIIcollagenonbiologicalcharacteristicsofhumanchondrocytes.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2014;18(30):4845-4850.引言隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，軟骨組織工程學(xué)為人們提供了更為理想的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損方法。如何獲得大規(guī)模具有增殖活性的種子細(xì)胞為當(dāng)前面臨的最大限制因素之一。1994年Brittberg[1]體外培養(yǎng)患者健康軟骨細(xì)胞，獲得大量純化軟骨細(xì)胞，再移植到其關(guān)節(jié)軟骨缺損部位治療關(guān)節(jié)軟骨缺損，開創(chuàng)了應(yīng)用自體軟骨細(xì)胞移植治療軟骨損傷的新技術(shù)。該技術(shù)在1997年得到美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)后已在歐洲國(guó)家廣泛使用，獲得大量純化且具有再生活力的軟骨細(xì)胞是該技術(shù)的關(guān)鍵，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代會(huì)發(fā)生去分化現(xiàn)象，喪失成軟骨能力。為了解決體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的去分化現(xiàn)象，越來越多的研究被報(bào)道，早在1975年就有實(shí)驗(yàn)證明膠原蛋白底物具有刺激成軟骨的作用[2]。膠原也稱膠原蛋白，是脊椎動(dòng)物體內(nèi)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，人體內(nèi)含量非常豐富，占動(dòng)物體膠原纖維固體物的80%-90%，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%-30%，也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分[3]。由于膠原蛋白是天然的生物資源，來源廣泛且具有獨(dú)特的生物相容性、可降解性、低免疫原性，還有如高拉伸強(qiáng)度、止血性能及促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等獨(dú)特的性能，被越來越重視。由于膠原蛋白具有止血、促進(jìn)組織再生和功能恢復(fù)的作用，被制成海綿、絲線、薄膜等醫(yī)療器械用于普外科、口腔、血管外科等多個(gè)科室，同時(shí)也因其組織相容性、可降解性被作為皮膚移植材料用于燒傷、創(chuàng)傷的修補(bǔ)。19世紀(jì)80年代，Zyderm膠原植入物被作為一種注射型膠原蛋白制劑在臨床上開始使用，在治療面部軟組織變形方面已使用近30年[4]。人們成功將膠原蛋白制成各種各樣的組織工程支架，如皮膚、骨組織、氣管和血管支架，Award等[5]混合自體同源間葉細(xì)胞的莖狀細(xì)胞和膠原蛋白凝膠制作肌腱用于腱后修復(fù)。Wakitani等[6]用嵌入軟骨細(xì)胞的膠原蛋白凝膠修復(fù)軟骨缺陷。膠原蛋白作為天然高分子生物材料已被證實(shí)可作為軟骨組織工程支架材料，并且它作為底物能刺激軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，可用于體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，但關(guān)于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)使用Ⅰ、Ⅱ型膠原包被培養(yǎng)板和普通培養(yǎng)板同時(shí)培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞，研究Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對(duì)人軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。?材料和方法設(shè)計(jì)：前瞻性實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn)：于2008年1月至2009年4月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所完成。材料：收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科因股骨頸骨折行?全髖置換20例患者的股骨頭標(biāo)本，患者年齡56-84歲，平均66歲。供者對(duì)實(shí)驗(yàn)均知情同意并簽署知情同意書。?實(shí)驗(yàn)方法：軟骨細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：將收集的關(guān)節(jié)軟骨以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒后，用手術(shù)刀片刮除關(guān)節(jié)表面軟組織及可能覆蓋在其上的滑膜，再將關(guān)節(jié)表面軟骨薄層組織削下來，使削下的軟骨組織盡量薄，不能削到軟骨下骨。將收集的軟骨組織片放入裝有含青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100U/mL)的PBS中漂洗3次，洗去軟骨表面血液及可能存在的滑膜，然后移入小玻璃瓶里，剪成1.0-2.0mm3，在含雙抗的PBS清洗后轉(zhuǎn)入50mL離心管內(nèi)，加入0.2%Ⅱ型膠原酶2mL消化。將消化后的軟骨組織和液體通過200目金屬篩網(wǎng)，將未消化的軟骨組織殘?jiān)湃?0mL離心管中，加入Ⅱ型膠原酶及DMEM繼續(xù)消化，根據(jù)消化程度決定消化時(shí)間，但消化時(shí)間最長(zhǎng)不超過12h為宜。過濾得到的液體放入15mL離心管中，1000r/min離心7min，去上清，加DMEM吹打，盡量輕柔，再次1000r/min離心7min后棄去上清，反復(fù)清洗3次洗去Ⅱ型膠原酶。將錐蟲藍(lán)檢測(cè)活力大于95%的原代軟骨細(xì)胞以4×108L-1濃度接種于25cm2塑料培養(yǎng)培養(yǎng)瓶。待軟骨細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶85%以上，棄原培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加2.0-3.0mL含EDTA的0.25%胰酶(以剛好覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜)消化2min，鏡下觀察貼壁細(xì)胞變圓脫落，待細(xì)胞大部分脫落后，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。將消化下的細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液混勻后移入15mL離心管，1000r/min離心7min，棄上清，加含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，按1∶2接種于兩個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，記
2019-07-23
骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)與其力學(xué)性能
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2019-07-22
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2019-07-21
