膠原探索
骨質疏松性骨折愈合過程中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達與其力學性能
Correlations between type Ⅰ and Ⅱ collagen expressions and mechanical strength in osteoporotic fracture healing
Yuan Shao-hui, Liu Wei, Wu Bin-qi, Han Xi-guang, Bo Chao-gang
Abstract
BACKGROUND: Studies have demonstrated that osteoporosis is a complex pathophysiological process involves changes of type Ⅰ collagen number and physical or chemical properties. However, reports addressing correlations between type Ⅰ and Ⅱ collagen expression are few.
OBJECTIVE: To disclose the change rules of type Ⅰ and Ⅱ collagen protein during osteoporotic fracture healing in rats and the correlation of them with mechanical strength.
METHODS: Rats were randomly divided into osteoporotic fracture and general fracture groups. Rats in the former group received ovariectomy. The expressions of type Ⅰ, Ⅱ collagen were observed by Western blot at 1, 2, 4, 5, 8 and 12 weeks. The bone mineral density was examined by dual-energy X-ray absorptiometry, and biomechanical testing were performed at 4, 8, 12 and 16 weeks postoperatively.
RESULTS AND CONCLUSION: There were significant differences between the osteoporotic fracture group and general fracture group in type Ⅰ and Ⅱ collagen expression and bone mineral density at different time points after injury (P < 0.05). With the injury time prolonged, the downward trend was more obviously. The type Ⅰ and Ⅱ collagen were correlated with maximum torque, elastic modulus, and maximum torsion angle in the osteoporotic fracture group (P < 0.05). The results showed that abnormal secretion of type Ⅰ and Ⅱ collagen osteoporotic fracture healing decreases mechanical strength and reduce the quality of fracture healing, which is the main reason for re-fracture.
Yuan SH, Liu W, Wu BQ, Han XG, Bo CG. Correlations between type Ⅰ and Ⅱ collagen expressions and mechanical strength in osteoporotic fracture healing.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(2): 208-212.
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摘要
背景：研究顯示骨質疏松癥是涉及Ⅰ型膠原數量及理化性質改變的一種復雜病理生理過程，但有關骨質疏松與Ⅰ，Ⅱ型膠原間的相關性，至今少有報道。
目的：觀察骨質疏松性骨折愈合中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達的變化規律，及其與生物力學性能的相關性。
方法：將大鼠隨機分為骨質疏松性骨折組與一般性骨折組。骨質疏松性骨折組切除卵巢建立骨質疏松模型。分別于骨折損傷后 1，2，4，5，8，12 周采用Western blot 方法檢測骨痂中Ⅰ，Ⅱ型膠原的蛋白表達，于損傷后 4，8，12，16 周進行骨密度測定與生物力學性能測試。
結果與結論：骨質疏松性骨折組Ⅰ，Ⅱ型膠原的表達及骨密度值在損傷后各時間點與一般性骨折組相比均差異有顯著性意義(P < 0.05)，且隨著損傷時間的延長，下降趨勢更明顯。骨質疏松性骨折組中Ⅰ，Ⅱ型膠原與最大轉矩、彈性模量、最大扭轉角均有相關性(P < 0.05)。結果顯示，骨質疏松性骨折愈合過程中Ⅰ，Ⅱ型膠原的分泌異常改變導致了其力學強度乃至骨折愈合質量的降低，影響骨折愈合，是再次骨折發生的主要原因。
關鍵詞：膠原；骨質疏松；骨密度；生物力學；骨組織工程
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.02.005
袁紹輝，劉偉，吳濱奇，韓希光，薄超剛. 骨質疏松性骨折愈合過程中Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白表達與其力學性能[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(2):208-212. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
0 引 言
骨質疏松癥以低骨量和骨組織微結構破壞
為特征，其最嚴重的后果是發生骨質疏松性骨折。目前常用的骨質疏松評價指標包括骨密度、骨代謝生化指標、骨生物力學強度及骨小梁顯微結構。實驗在建立骨質疏松性大鼠骨折模型的基礎上，以骨有機質即骨Ⅰ，Ⅱ型膠原為主要研究對象，觀察大鼠骨質疏松性骨折骨痂愈合過程中骨膠原含量變化規律，以及其變化與生物力學強度變化的相關性，從而為骨質疏松骨折的診斷與治療提供理論依據。
1 材料和方法
主要儀器及試劑：
| 試劑及儀器 | 來源 |
| Fax itron 樣本放射系統 | 美國Itron 公司 |
| AG-I 生物力學測量系統 | 日本島津公司 |
| DPX2L 型雙能 X 射線骨密度儀 | 美國Lunar 公司 |
| WDS2100 型計算機電子萬能力學試驗系統 | 日本松下公司 |
| SPECTRAMAX 190 連續光譜微孔板光密度測量儀 | 美國MDC 公司美 |
| Gel Doc2000 圖像分析系統 | 國Bio-Rad 公司 |
| 鼠抗人Ⅰ，Ⅱ型膠原單克隆抗體 | 美國Invitrogen 公司 |
| 兔抗鼠IgG | 美國Santa Cruz 公司 |
實驗方法
分組與建模：將50只大鼠隨機分為骨質疏松性骨折組與一般性骨折組，每組25只。各組動物在腹腔注射麻醉
(氯氨酮 0.1 g/kg)后，大鼠的呼吸心跳平穩后將其固定于操作手術臺上，脫毛后消毒。骨質疏松性骨折組開腹后切除雙側卵巢后縫合，一般性骨折組開腹后切除少量脂肪組織后縫合。
術后3個月，所有實驗動物在麻醉下，建立兩組骨折模型：骨質疏松性骨折組骨折模型和一般性骨折組骨折模型[2]。取兩組大鼠股外側切口，經股前、外側肌群， 標準號髓腔逆行內固定。全部實驗小鼠于術后當日立即使用Fax itron樣本放射系統拍攝X射線片并判斷建模成功與否[3]。
Western blot 法檢測Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達：兩組動物分別于骨折損傷后1，2，4，5，8，12周處死[4-5]，每個時相點3只，骨痂在-80 ℃ 條件下保存直待標本備齊。將骨折標本置于200 g/L 的乙二胺四乙酸中4 ℃下脫鈣
1周。取脫鈣骨組織按組織裂解法提取蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度[6]。
骨痂中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達的Western blot免疫印記分析：蛋白先進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，取出硝酸纖維素薄膜置入20 g/L 牛血清白蛋白/PBST 液中37箱過夜，Ⅰ型膠原一抗為鼠抗人Ⅰ型膠原單克隆抗體(1∶1 500)，二抗為兔抗鼠IgG(1∶2 000)。Ⅱ型膠原一抗為Ⅱ型膠原單克隆抗體(1∶200)，次日漂洗硝酸纖維素薄膜3次，5 min/次，再加入適當稀釋的二抗，室溫2 h，取出再次漂洗3次，5 min/次，ECL顯色，X射線膠片曝光顯影。
檢測Ⅰ，Ⅱ型膠原表達時各時相點均取5個骨折端蛋白樣本進行檢測。將X射線膠片置于Gel Doc2 000圖
像分析系統。測定目的條帶的平均吸光度值，并將5次實驗結果的平均值作為蛋白含量的相對值。
骨痂組織的骨密度測定：于骨折實驗模型建立后的4，8，12，16 周每組各處死4只大鼠[7]，摘取股骨標本在
DPX2L 型雙能X射線骨密度儀下以股骨骨痂為中心，掃描2 cm階段。測試完畢后，用生理鹽水濕紗布包敷，塑料袋密封后置于-20 ℃冰箱中，以備力學測試使用。
力學性能測試：將已進行骨密度測定的股骨標本自
-20 ℃冰箱中取出逐級解凍，并在室溫下自然復溫，板厚千分尺測量股骨長度與骨痂矢狀徑、橫徑，并計算兩組傷后不同骨折愈合時間相應骨痂組織橫狀經和骨痂截面積。
于骨痂邊緣側選3 mm×4 mm的骨表面，粗砂紙使骨表面平坦、粗糙，體積分數100%丙酮表面脫酯，干燥后進行測定。用WDS2100型計算機電子萬能力學試驗系統進行三點彎曲試驗。承載點跨距為30 mm，加載點取脛骨中點，加載速度為2 mm/min。脛骨兩端用方形骨水泥固定，防止加載時脛骨旋轉，保持各標本位置一致，檢測時保持標本濕潤狀態，進行股骨扭轉強度測試，測量兩組骨痂組織最大轉矩、彈性模量(g×cm2/deg) 和最大扭轉角(deg/cm)。
主要觀察指標：兩組傷后Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白的表達
及其與傷后骨密度與生物力學性能(最大轉矩、彈性模量、最大扭轉角)之間的相關性。
統計學分析：計量資料用x±s表示，用SPSS13.0 統
計軟件包對數據進統計學分析處理。Ⅰ，Ⅱ型膠原表達水平之間的顯著性檢驗采用兩樣本t 檢驗；計算每對標本的力學參數比率，組間差異判斷用方差分折法，Ⅰ，
Ⅱ型膠原與最大轉矩、彈性模量、最大扭轉角間的相關性分析采用線性回歸法，P < 0.05為差異有顯著性意義。
結果
2.1實驗動物數量分析 納入大鼠50只均進入結果分析，無死亡和感染，無脫落。
2.2Ⅰ，Ⅱ型膠原的表達 見圖1和表1。
骨質疏松性骨折組Ⅰ，Ⅱ型膠原的表達在損傷后各時間點與一般性骨折組相比均差異有顯著性意義(P <
0.05)，且隨著損傷時間的延長，下降趨勢更明顯。
骨痂組織的骨密度變化 兩組骨密度值在骨折實驗模型建立術后的4，8，12，16 周均低于一般性骨折組(P < 0.05)；兩組均在8周時達高峰，隨后降低；16周時骨質疏松性骨折組骨密度下降最明顯(P < 0.05)，見表2。
生物力學測定結果 兩組骨痂組織橫狀徑及骨痂截面積均在骨折后8周達高峰(P < 0.05)，隨后逐漸下降，但骨質疏松性骨折組均較一般性骨折組高(P <
0.05)。
兩組骨痂組織最大轉矩在骨折后4周差異較小，
8~12周一般性骨折組逐漸上升，骨質疏松性骨折組在第
8周有所下降后在第12，16周逐漸上升，并低于一般性骨折組(P < 0.05)。
兩組骨痂組織彈性模量均在骨折后第8周均達到高峰，第12~16周逐漸下降，骨質疏松性骨折組各時間段均低于一般性骨折組(P < 0.05)。
骨質疏松性骨折組痂組織最大扭轉角在骨折后第
4~12周均高于一般性骨折組(P < 0.05)，第12周達高峰后，第16周明顯下降，低于一般性骨折組(P < 0.05)， 一般性骨折組第4~16周持續上升，第16周兩組間差異有顯著性意義(P < 0.05)。
兩組的力學參數具體變化見表3。
2.5骨質疏松性骨折組骨痂組織中Ⅰ、Ⅱ型膠原與骨痂組織力學參數相關性分析 將骨質疏松性骨折組各數據進行正態性檢驗，均為正態性分布，再行直線相關性分析，結果顯示：骨質疏松性骨折組中Ⅰ型膠原與最大轉矩、彈性模量和最大扭轉角相關系數r 值分別為
0.812，0.848和0.604 (P < 0. 05)；Ⅱ型膠原與最大轉矩、彈性模量和最大扭轉角相關系數r 值分別為0.759，
0.807和0.586 (P < 0. 05)。骨質疏松性骨折組骨痂組織橫狀徑、截面積、最大轉矩、彈性模量及最大扭轉角之間均呈明顯的線性回歸關系。
討論
骨基質包括有機質和無機質。有機質主要為膠原纖維(主要為Ⅰ，Ⅱ型膠原纖維)和少量的無定型基質，無機質即骨鹽，為結晶的羥磷灰石和無定型的膠體磷鈣。膠原纖維是組成骨構架和維持骨的力學強度的基質蛋白。骨形成即骨礦化是無定型的磷酸鈣及其它骨鹽規律的沉積在骨有機質間隙內的過程，骨膠原是骨礦化的核心。去卵巢大鼠模型是目前公認為與臨床最接近的絕經后骨質疏松動物模型[8]。雌激素可促進成骨細胞Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶和轉化生長因子β等的合成和分泌, 從而促進骨形成[9]。大鼠雙側卵巢切除后雌激素合成和分泌減少，使成骨細胞骨膠原合成減少，分解代謝加快, 使骨吸收大于骨形成進而導致骨量的丟失和骨生物力學強度的降低，最終致骨質疏松癥[10]。
3.1Ⅰ型膠原在大鼠骨質疏松性骨折及正常骨折愈合過程中的表達規律 實驗發現，骨質疏松性骨折組Ⅰ型膠原在骨折后第2周達峰值，遲于一般性骨折組，且峰值低于后者，在骨折后第8周起Ⅰ型膠原值開始回落， 并在各時間段均低于一般性骨折組。以往研究認為,骨質疏松是以骨無機質減少，骨量下降，脆性增加為特征的全身性代謝骨病[11]。研究表明，骨質鈣鹽減少所致的骨量丟失，可致骨密度降低，骨小梁稀疏變細，但是骨生物力學參數并未明顯的降低，單純骨鈣降低并不能很好的解釋骨質疏松患者易于發生骨折這以一現象[6]。但其峰值點低于一般性骨折組，同時在峰值后的各時間段內，Ⅰ型膠原的含量均低于一般性骨折組，說明骨質疏松組織中骨基質中有機質形成因子的減少[12-13]，導致膠原的合成峰達到過早和提前衰落，細胞功能亢進轉為抑制, 成骨細胞的活性受到影響，由成骨細胞分泌的Ⅰ型膠原量減少，骨痂鈣化、骨化遇到延緩，Ⅰ型膠原是促成骨細胞分化和增強成骨細胞黏附能力主要因素[8]，是成骨細胞表型成熟和鈣結節形成的形成骨機械力量的基本保障，是組成骨構架的基質蛋白。Ⅰ型膠原數量的改變，勢必導致骨痂的骨礦鈣化延遲。實驗結果表明Ⅰ 型膠原的蛋白表達量顯著低于正常骨折組，膠原纖維合成減少，為骨礦化提供框架的機械支持功能降低，使得鈣鹽等無機質無法沉積礦化，最終使骨吸收增加。
3.2Ⅱ型膠原在大鼠骨質疏松性骨折及正常骨折愈合過程中的表達規律 實驗發現兩組的Ⅰ，Ⅱ型膠原的蛋白表達隨骨折愈合時間變化也呈現由低表達到高表達， 再回落到低表達，峰值與低值對應的時間點兩組相同：
Ⅰ型膠原兩組峰值在傷后4周；Ⅱ型膠原兩組峰值在傷后2周。區別在于各時間點尤其是在峰值點上表達量差異有顯著性意義。說明骨質疏松性骨折愈合中Ⅰ，Ⅱ型膠原的分泌規律與正常骨折愈合規律是一樣的，但其表達量的差異將可能是導致骨質疏松性骨折不同臨床愈合結局的原因之一[14-15]。
實驗結果提示，骨質疏松性骨折愈合過程中Ⅱ型膠原峰值達到時間較早，可能是由于在骨質疏松性骨折愈合早期軟骨細胞功能亢進，釋放大量Ⅱ型膠原, 這與臨床中發現伴有骨質疏松性骨折斷端處早期可以見到大量的軟骨性骨痂相吻合[16]。傷后第4周Ⅰ型膠原量達高峰后，機體成骨細胞的活性受到影響，其分泌量減少， 骨痂鈣化、骨化遇到延緩，實驗結果表明Ⅰ型膠原的蛋白表達量顯著低于正常骨折組，臨床表現為骨折斷端骨化差，愈合質量差，生物力學性能不佳。
大鼠骨質疏松性骨折及正常骨折愈合過程中骨密度的變化 骨密度常作為全面評價骨質疏松骨強度和預測骨折危險性的一個可靠指標，大量的動物實驗和臨床研究的結果表明單純骨密度增加，骨質量全未必增加，反而降低，因此骨的生物力學測試是評價骨質量最
有說服力的指標之一。實驗采用了具有高度的精確性與靈敏性的雙能X射線骨密度儀進行骨痂骨密度檢測。實驗結果顯示，兩組骨密度值在各時間段(骨折實驗模型建立術后的4，8，12，16周)均低于一般性骨折組；兩組均在8周時達高峰，隨后降低；16周時OPFM 組骨密度下降最明顯。由于大鼠在骨折愈合過程中軟骨痂數量高于人類，使得軟骨痂的礦化及吸收的程度與速度對骨量的影響較顯著。有學者研究報導，骨質疏松性骨折愈合早期時鏡下觀察軟骨痂內肥大軟骨細胞數量增多，而外徑最大，表明范圍廣、礦化充分的軟骨痂決定了骨密度數值增高。至8周時，成熟的礦化軟骨痂漸被吸收，被幼稚小梁骨取代，外徑迅速縮小導致了骨密度下降；同時雌激素下降導致骨轉換率(負平衡)增高，成熟小梁骨被大量吸收、移除也是骨密度下降的原因之一[17-18]。
3.4Ⅰ，Ⅱ型膠原在大鼠骨質疏松性骨折及正常骨折愈合過程中與生物力學相關指標間的相關性 骨折部位的結構強度和剛度取決于骨痂的物質特性(強度和模量)和斷面幾何形狀(斷面面積和慣性運動) , 骨痂的力學和生化特性更類似于未成熟的密質骨。骨的愈合過程即骨的結構和生物力學特性的恢復。測定骨的力學性能變化是評判骨折愈合進展的最直接方法。研究表明骨折的剛度增強可達到最大彎曲強度的2倍，如果骨折剛度恢復到原來狀況時，強度為未損傷時的一半。由于力學性能測定在臨床應用難以實現，近年來，國內外學者致力于研究一種無創的可量化的方法來監測和評估骨愈合的進程，包括測定骨損害部位的骨量及骨密度、剛度、骨痂的量及骨代謝變化等。骨折端組織的機械強度和剛度是愈合的指標已被普遍接受。對骨折愈合的力學性能檢測，以往大多采用拉伸試驗與彎曲試驗(如三點彎曲、四點彎曲等)。有學者認為，骨結構的變化對骨組織力學性能的影響遠較骨量更重要[19-20]。實驗結果提示，骨質疏松性骨折愈合的骨痂組織橫狀徑、截面積、最大扭轉矩及其彈性模量在各個愈合時間段內基本低于一般性骨折組，而骨痂組織的最大扭轉角雖然在愈合的12周內高于一般性骨折組，但在16周時明顯低于一般性骨折組，說明由于骨折愈合的骨痂組織中有機質含量的差異，導致骨質疏松性骨折組的骨痂組織其力學性能降低，因而臨床工作中僅依靠X射線攝片或骨密度檢查， 并非能全面、客觀地反映骨質疏松性及骨折愈合程度。實驗結果示，骨質疏松性骨折組中Ⅰ，Ⅱ型膠原均與骨痂組織的最大轉矩和彈性模量呈高度直線相關，與骨痂最大扭轉角呈中度直線相關，提示骨質疏松性骨折由于骨膠原含量減少，為骨礦化提供框架的機械支持能力降低，使鈣鹽等無機質無法沉積礦化，骨折愈合的骨痂的生物力學強度下降，其與骨膠原含量下降有直線相關性。骨膠原數量減少和質量下降是造成骨質疏松性骨折再骨折發生的主要原因。
綜上所述，骨質疏松性骨折的生物力學強度下降，其骨膠原的變化是骨質疏松骨生物力學改變的主要原因，通過提高骨膠原的含量及質量來改善骨質的生物力學性能，可有效降低再骨折的發生率。
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基金資助：課題受黑龍江省教育廳科學技術研究項目基 金(11531149)資助。
作者貢獻：袁紹輝進行實驗設計。實驗實施為袁紹輝、 劉偉、吳濱奇和韓希光。實驗評估為袁紹輝和劉偉。資料收集為韓希光和薄超剛。袁紹輝成文、審校及對文章負責。
致謝：對參與本次實驗部分工作和提供實驗技術性幫助 的哈爾濱醫科大學附屬第一醫院中心實驗室表示感謝。
利益沖突：課題未涉及任何廠家及相關雇主或其他經濟 組織直接或間接的經濟或利益的贊助。
倫理批準：實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國 科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。
本文的創新點：對骨質疏松性骨折愈合過程中膠原蛋白 的表達規律及其與生物力學性能之間的相關性的研究還相對較少，現有文獻僅停留在多種膠原蛋白在骨質疏松骨基質中的表達或某單個膠原蛋白在骨質疏松性骨折愈合過程中的表達。作者查閱大量文獻后尚未見到Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白在骨質疏松性骨折愈合過程中的表達規律及其臨床意義。實驗采用分子生物學技術研究了骨質疏松性骨折愈合中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達的變化規律，及其與生物力學性能的相關性。與國內外同類研究水平的比較，實驗在技術和研究結果層面上創新性的體現了骨質疏松性骨折愈合過程中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白的表達規律，及其與骨折生物力學性能直接的相關性。
“以上內容為營養科普知識，僅供消費者參考學習。相關內容不代表產品功效，請消費者理性閱讀。”